Larry Daley gelooft, ondanks zijn tot op heden ongelukkige leven, dat er iets groots voor hem staat te gebeuren. Dat blijkt wel als hij aangenomen wordt als nachtwaker bij het "Museum of Natural History". Tijdens zijn diensten beginnen er vreemde dingen te gebeuren. Gladiatoren en cowboys voeren een nachtelijke strijd terwijl een Neanderthaler zijn eigen display verbrandt, en de T-rex iedereen laat zien waarom hij het meest gevreesde roofdier is uit de geschiedenis.

Als het "Museum of Natural History" gesloten wordt vanwege renovaties, moeten de museumstukken overgebracht worden naar het beroemde "Washington Museum". Larry Daley (Ben Stiller) komt terecht in de zogenaamde Smithsonian-instelling van het museum, waar hij de opdracht krijgt om een aantal museumstukken te redden, omdat deze verkeerd zijn verscheept. Eenmaal geïnfiltreerd in het Smithsonian ziet Larry dat er weer leven zit in alle museumstukken, waaronder Amelia Earhart (Amy Adams), Al Capone en vele andere historische personen.

Een jongen wordt verliefd op een serveerster en aan de hand van haar Facebookprofiel verandert hij zichzelf tot het ideale vriendje. Maar als de gevoelens wederzijds blijken te zijn moet hij zich in wel heel rare bochten wringen om zijn act vol te houden.

Larey Daley weet dat een Egyptisch tablet uit de tijd van de farao's het geheim is achter de tot leven komende museumstukken in het "Museum of Natural History". Maar wanneer dit magisch tablet tekenen van corrosie begint te vertonen, reist Larry met onder andere Farao Ahkmenrah, Teddy Roosevelt en Attila de Hun af naar het "British Museum" in Londen om het te redden van zijn ondergang.

Automonteur Lenny Burroughs is chauffeur van gangsterbaas Trevor Morrisen en alhoewel het een lucratief baantje is belooft hij zijn verloofde te stoppen zodra ze getrouwd zijn. Maar alles gaat vreselijk mis als Lenny betrokken raakt bij de kidnapping van de rivaliserende gangster, Jimmy Berg.