Supernatural gaat over de broers Winchester die het bovennatuurlijke kwaad bestrijden. Ze nemen hierbij de taak van hun vader John over, die hiermee begonnen is om de dood van zijn vrouw te wreken. Dankzij hun vader groeien Sam en Dean op als demonenjagers. In elke aflevering lossen Dean en Sam een mysterie op door met een bovennatuurlijke tegenstander af te rekenen. Mysteries draaien meestal om kwaadaardige geesten, maar ook vampiers, weerwolven en andere demonen moeten worden verslagen.

De serie draait om een forensisch team in de stad Las Vegas. De taak van dit team is om verschillende misdrijven op te lossen. Dit kan een moord, verkrachting of een opzettelijke (woning)brand zijn. Het team stond de eerste acht seizoenen onder leiding van Gill Grissom, en sinds halverwege seizoen negen Catherine Willows (gespeeld door Marg Helgenberger). De huidige teamleider is DB Russel, een rol gespeeld door Ted Danson. Het team heeft een forensisch laboratorium tot zijn beschikking. Met behulp van bewijsmateriaal bestaande uit onder andere DNA, vingerafdrukken en het eventuele lijk moet het proberen uit te zoeken wie de dader is.